การพิสูจน์ยืนยันการติดเชื้อ Streptococcus suis ต้องอาศัยการเพาะเชื้อจากสิ่งส่งตรวจทางห้องปฏิบัติการ เพื่อตรวจหาจุลชีพในสิ่งส่งตรวจและทำการแยกเชื้อ

การเก็บตัวอย่างและการส่งตรวจ

     ตัวอย่างสิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วย ผู้ป่วยทุกรายควรส่งเลือด น้ำไขสันหลัง และจากรอยโรค เช่น น้ำเจาะข้อ น้ำจากช่องท้อง โดยให้นำส่งห้องปฏิบัติการทันที ที่อุณหภูมิห้อง

การย้อมแกรมจากสิ่งส่งตรวจโดยตรง (Direct gram stained smear)

    การย้อมแกรมจากสิ่งส่งตรวจโดยตรงเป็นวิธีที่ช่วยวินิจฉัยเบื้องต้นได้เร็ว หากได้น้ำไขสันหลังในปริมาณที่มากพอ (1-2 ml) ควร centrifuge เพื่อให้ได้ตะกอนมาทำการย้อมและเพาะเชื้อ ซึ่งจะมีโอกาสพบเชื้อได้มาก สำหรับ hemoculture หลังบ่ม หากมีสัญญาณว่าน่าจะมีเชื้อก็ให้ย้อมเช่นกัน ในผู้ป่วยที่มีอาการ sepsis หรือ meningitis ที่มีประวัติสัมผัส หรือบริโภคเนื้อสุกร / เลือดสุกรดิบ เมื่อพบ cocci ติดสีแกรมบวก เรียงกันเป็นสายสั้นๆ (short chain) ให้สงสัยว่ามีการติดเชื้อ Streptococcus suis

การเก็บตัวอย่าง

    ผู้ป่วยติดเชื้อ S. suis ส่วนใหญ่จะมีอาการ septicemia หรือ meningitis จึงควรตรวจหาเชื้อจากเลือดหรือ น้ำไขสันหลัง (CSF) วิธีการเก็บและปริมาณของตัวอย่างที่ถูกต้องเหมาะสม จะเพิ่มโอกาสในการตรวจพบเชื้อได้มาก

ตัวอย่างเลือด ใช้วิธีมาตรฐานการเพาะเชื้อแบคทีเรียจากเลือด โดยเจาะเลือดด้วยวิธีปลอดเชื้อ และเจาะก่อนได้รับยาปฏิชีวนะ

    ในผู้ป่วย acute sepsis หรือ meningitis ที่เป็นผู้ใหญ่ ให้เจาะเลือด 2 ตำแหน่ง เพาะลงในขวด hemoculture ตำแหน่งละขวด (รวม 2 ขวด) ปริมาณเลือดที่เจาะ 10 มล. /ตำแหน่ง/ขวด ในผู้ป่วยน้ำหนักมากกว่า 60 กิโลกรัม ไม่ควรเจาะน้อยกว่า 10 มล./ตำแหน่ง/ขวด สำหรับเด็กอายุ 1–6 ปี ปริมาณเลือดที่เจาะแปรตามอายุ คือ 0.5 มล./ขวบ/ตำแหน่ง/ขวด ตัวอย่างเช่น เด็กอายุ 3 ขวบ เจาะเลือด 1.5 มล. เด็กอายุน้อยกว่า 1 ขวบ เจาะเพียงตำแหน่งเดียวในปริมาณ 0.5- 1.5 มล. และเพาะลงในขวด hemoculture 1 ขวด

    ในผู้ป่วยที่เป็น subacute endocarditis หรือ continuous bacteremia ให้เจาะเลือด 2 ครั้ง ครั้งที่ 1 เจาะ 2 ตำแหน่ง เพาะลงในขวด hemoculture 2 ขวด และเจาะครั้งที่ 2 ห่างจากเจาะครั้งแรกเป็นเวลาไม่น้อยกว่า 1 ชั่วโมง เพื่อเพาะลงขวด hemoculture ขวดที่ 3

    ทั้งนี้การเจาะเลือดเพื่อทำ hemoculture ต้องทำก่อนที่ผู้ป่วยจะได้รับยาต้านจุลชีพ หากผู้ป่วยได้รับยาต้านจุลชีพมาก่อนที่จะทำ hemoculture ควรเจาะเมื่อปริมาณยาในกระแสเลือดอยู่ในระดับต่ำสุด และควรใช้ขวดที่มี hemoculture broth ที่มีสารทำลายฤทธิ์ของยาต้านจุลชีพ ได้แก่ resin สาร antifoaming หรือ anticoagulant ได้แก่ 0.025 – 0.05% sodium polyanetholesulfonate (SPS) ใช้ทำ hemoculture สำเร็จรูปที่มีขายตามท้องตลาดจะมีสารดังกล่าวอยู่ ซึ่งจะทำให้พบเชื้อได้ดีขึ้น นอกจากนี้อัตราการเจือจางระหว่างเลือดและอาหารเหลวที่เหมาะสม ก็จะช่วยให้พบเชื้อในผู้ป่วยที่เคยได้รับยาต้านจุลชีพได้ดีขึ้น (โดยทั่วไปสัดส่วนของเลือดต่ออาหารเหลวเท่ากับ 1 : 5 - 1 : 10)

ตัวอย่างน้ำไขสันหลัง ในผู้ป่วยที่เป็น meningitis เจาะน้ำไขสันหลัง 3–5 มิลลิลิตร โดยทั่วไปน้ำไขสันหลังที่เกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรียมักจะขุ่น และมีเม็ดเลือดขาวชนิดนิวโทรฟิลมาก โปรตีนสูง แต่มีกลูโคสต่ำ

ตัวอย่างน้ำเจาะจากรอยโรค เก็บตัวอย่างใส่ในภาชนะปลอดเชื้อ

    การนำสิ่งส่งตรวจส่งห้องปฏิบัติการ เมื่อเก็บสิ่งส่งตรวจที่สงสัยได้แล้ว ปิดฝาจุกให้แน่นและรีบนำส่ง ห้องปฏิบัติการทันทีที่อุณหภูมิห้อง Label หลอดแก้วให้เรียบร้อยเพื่อกันการสับสน พร้อมทั้ง ใบนำส่งที่มีรายละเอียดตามแบบฟอร์ม

การเพาะเชื้อ

     หลังจากบ่มขวด hemoculture ในกรณีเครื่องอัตโนมัติ เมื่อมีสัญญาณเชื้อขึ้นให้ย้อมแกรมและ subculture ทันที ส่วน hemoculture ที่ไม่ใช่เครื่องอัตโนมัติ ให้ subculture หลังบ่มข้ามคืน หากเชื้อยังไม่ขึ้นให้บ่มต่อและสังเกตการเจริญของเชื้อทุกวัน อาหารเลี้ยงเชื้อมาตรฐานที่ใช้ในการเพาะหาเชื้อก่อโรคจาก haemoculture , CSF และน้ำเจาะจากรอยโรค คือ Sheep blood agar , Chocolate agar และ Mc Conkey ทำการ streak เชื้อจากตัวอย่างบนอาหารด้วยเทคนิกทั่วไปทางจุลชีววิทยา และบ่มที่อุณหภูมิ 35 – 37°C ในบรรยากาศที่มี CO₂ 5 – 7% (Streptococcus suis ขึ้นได้ที่บรรยากาศทั่วไป แต่จะเจริญได้ดีในบรรยากาศที่มี CO₂ โดยจะเน้นวิธีการ streak บนเชื้อ Sheep blood agar (SBA) เนื่องจากการสังเกต hemolysis มีความสำคัญในการแยกเชื้อ Streptococcus suis ออกจาก Streptococcus species อื่น
    เชื้อ Streptococcus suis เป็นเชื้อ non–beta hemolytic แต่ให้ ß - hemolysis บน horse blood agar tang.J. รายงานการระบาดของเชื้อ Streptococcus suis ในประเทศจีนพบว่าเป็น α - hemolysis บน SAB ดังนั้นในการเพาะเลี้ยงเชื้อส่วนหนึ่งควร stab ลงในเนื้อวุ้นเพื่อให้เซลล์อยู่ในสภาพไร้อากาศ
    เชื้อ Streptococcus ที่ให้ ß - hemolysis โดย o2 - labile hemolysis จะเห็น ß – hemolysis ได้ดีเมื่อเชื้ออยู่ในสภาพที่ขาดออกซิเจนหรืออยู่ใต้วุ้น หากเชื้อที่สงสัยเป็น ß – hemolysis ตรงบริเวณที่ stab แสดงว่าเชื้อนั้นไม่ใช่ Streptococcus suis

การแยกชนิด

    ห้องปฏิบัติการทั่วไป ที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อและน้ำยาทดสอบจำกัด มักรายงานเชื้อที่ไม่มี hemolysis และเชื้อที่ให้ ? - hemolysis (ยกเว้น S. pneumoniae ) เป็น Viridans Streptococcus ดังนั้นในอดีตจึงไม่มีการรายงานการแยกชนิดเชื้อ Streptococcus suis เมื่อย้อมเชื้อ Streptococcus suis ที่ขึ้นในอาหารเหลว ลักษณะเซลล์เป็นแกรมบวก รูปร่างกลม บางครั้งอาจพบเป็นรูปรี หรือแท่งสั้นๆ ติดกันเป็นคู่ และเรียงตัวเป็นสายคล้ายกับเชื้อกลุ่ม enterococci , lactococci , leuconostoc spp. , Vagococcus spp. และ Globiccatella spp. สามารถดูการเรียงตัวของเซลล์ได้ดีที่สุด เมื่อย้อมแกรมจากเชื้อใน Thioglycollate broth โดย smear broth บนแผ่นสไลด์ ทิ้งไว้ให้แห้ง และ fix methanol แทนการ fix ด้วยความร้อนแล้วจึงย้อมแกรม เมื่อเชื้อ Streptococcus suis ขึ้นบน Sheep blood agar (SBA) ทุกสายพันธุ์ จะให้ ? - hemolysis เชื้อนี้ให้ผล oxidase ลบ , catalase ลบ , ไม่เคลื่อนที่ , optochin resistant และทุกสายพันธุ์ hydrolyze esculin ลักษณะกายภาพคล้าย Viridans Streptococcus ได้แก่ S. gordanil , S. sanguinis และ S. parasanguinis นอกจากการแยกชนิดเชื้อโดยวิธีดั้งเดิม (conventional method) ดังที่กล่าวมาแล้ว ปัจจุบันสามารถใช้ชุดทดสอบสำหรับแยกชนิดเชื้อ Streptococcus suis ซึ่งมีจำหน่ายในประเทศไทย คือ API Rapid Strep System ได้แก่ API 20 Strep (มี 20 test) และ Rapid ID 32 Strep (มี 32 test) ของบริษัท Bio Merieux อย่างไรก็ตามการแยกชนิดได้ถูกต้องแม่นยำจะต้องทำ capsular serotyping ด้วย

การหา serotype ของเชื้อ Streptococcus suis

    เชื้อ Streptococcus suis มีประมาณ 35 serotype ซึ่งเชื้อที่แยกได้จากสิ่งส่งตรวจในคนมักเป็น capsular serotype 2 มากที่สุด ปัจจุบันสถาบัน Staten Serum Institute เมืองโคเปนเฮเกน ประเทศเดนมาร์ค จำหน่าย Antisera ต่อ capsular polysaccharide ทั้ง 35 serotypes คือ capsular serotypes 1 ถึง 34 และ serotype ? นอกจาก antisera แล้วยังมี Coagglutination test kit ของ Laboratory Biovet สำหรับใช้ในการทำ serotyping (39,40) การทำ capsular typing อาจจะทำได้โดยการหาลำดับของ capsular cps genes

การตรวจหาเชื้อ Streptococcus suis และการทำ serotyping โดยวิธี PCR

    มีรายงานการใช้วิธีทางชีวโมเลกุลได้แก่ Multiplex PCR Assay ในการตรวจหา สเตร็พโตค็อกคัส ซูอิส serotype 2 และ ½ (10)

สรุปการวินิจฉัยเชื้อ Streptococcus suis

1. ลักษณะโคโลนี การสลายเม็ดเลือดแดงบน blood agar plate

- โคโลนีสีเทาใส ขนาดเล็ก เส้นผ่าศูนย์กลาง 2-3 μm

- ให้ α - hemolysis โดยรอบโคโลนีใสเล็กน้อย เมื่อเลี้ยงบนอาหารที่ใช้เลือดคน ถ้าดูก้น plate จะเห็นสีเขียว

2. ย้อมสีแกรมจะติดสีแกรมบวก รูปร่างกลมหรือค่อนข้างรี ติดกันเป็นคู่ และเป็นสาย